肝细胞癌免疫治疗的生物标志物研究
前言
肝细胞癌是全球第六大最常见的恶性肿瘤，在2020年导致数十万人死亡，然而，目前晚期肝细胞癌患者的治疗选择仍然有限。肿瘤免疫治疗近年来发展迅速，尤其是在免疫检查点抑制剂（ICI）领域，这些药物旨在激活和增强抗肿瘤免疫，为晚期癌症患者的治疗提供了新的前景，包括肝癌。
目前，atezolizumab（抗PD－L1阻断剂）联合bevacizumab（VEGF抗体）在肝癌患者展示出令人鼓舞的临床结果。尽管如此，目前只有一小部分肝癌患者受益于ICI治疗，免疫相关不良事件（IRAE）的发生率也是一个重要问题，这突出表明需要更好地了解ICI与肿瘤的相互作用，以及识别免疫治疗反应的预测性生物标记物。
PD－L1
PD－L1在肿瘤细胞、抗原提呈细胞和其他免疫细胞表面广泛表达。据报道，PD－L1在HCC中的表达普遍较低（约占肿瘤细胞的10％），并且与复发和更短的OS相关。
已经发表了一些临床试验结果，其中PD－L1被评估为ICI反应的预测性生物标志物。在CheckMate 459 III期临床试验中，尽管nivolumab并未引起OS的显著改善，但PD－L1阳性肿瘤患者对nivolumab的反应优于索拉非尼。然而，PD－L1的预测价值尚不清楚，在CheckMate 040和NCT02658019试验中，无论PD－L1表达水平如何，所有患者的应答率都是令人失望的。即便如此，对CheckMate 040试验中患者的进一步分析表明，肿瘤PD－L1表达与OS的改善有关。
这些临床试验的矛盾结果可能部分是由于PD－L1水平检测的局限性，包括缺乏评估PD－L1表达及其时空异质性的标准方法，以及缺乏允许确定“过度表达”的标准阈值。有两种方法用于定义PD－L1阳性表达，即PD－L1阳性肿瘤细胞的比率，即所谓的肿瘤比例评分（TPS），以及PD－L1染色的肿瘤和免疫细胞的比率，即所谓的联合阳性评分（CPS）。KEYNOTE－224 II期试验使用两种评分方法对PD－L1进行了评估，CPS被证明是更适用的生物标记物。此外，PD－L1表达的预测值可能被低估，因为它通常在单个时间点进行评估，而PD－L1表达可能是动态和可诱导的。
肿瘤突变负荷／微卫星不稳定性
肿瘤突变负荷（TMB）是指单个肿瘤基因组中发现的非同义突变的数量，包括DNA损伤反应基因和编码DNA聚合酶＆epsilon；（POLE）和＆delta；（POLD）催化亚单位的基因改变，并已评估其作为多种肿瘤类型的生物标记物的潜力。
一项研究评估了755例HCC患者ICI反应的基因组生物标记物的频率，发现TMB中位数为4个突变／Mb，只有6例肿瘤（0．8％）发现高TMB。此外，在一个小样本病例（N＝17）中，TMB与ICI反应无相关性。然而，与PD－L1表达的情况一样，TMB测定缺乏标准化阈值，量化方法也存在差异。因此，应谨慎解释TMB的临床价值。
DNA错配修复（MMR）是维持基因组完整性和稳定性的关键机制。MMR活性的缺乏导致称为微卫星不稳定性（MSI）的超突变表型。一项研究评估了pembrolizumab单药治疗86例晚期MMR缺陷型癌症患者的疗效，ORR和完全缓解率（CR）分别为53％和21％，本研究结果支持MSI可作为实体瘤对PD－1阻断的临床反应的预测因子。虽然MSI被认为是选择ICI治疗应答者的一个指标，但仍然缺乏HCC患者的数据。Ang等人评估了542例HCC标本的MSI，发现只有一例（0．2％）高MSI和高TMB，而其他几项研究报告中，HCC中MSI的比率也普遍较低。这些发现强调MSI可能不是预测HCC患者ICIs反应的理想生物标志物。
肿瘤浸润淋巴细胞
由于TME内的T细胞浸润是免疫检查点阻断的先决条件，基线肿瘤内T细胞密度和表型已被广泛研究。CheckMate 040试验中进行的回顾性生物标记物分析表明，尽管无统计学意义，但经nivolumab治疗的HCC患者中CD3＋或CD8＋肿瘤浸润性T细胞数量的增加与OS改善趋势相关。该研究进一步表明，CD3＋T细胞频率的增加与最佳总体反应之间存在关联。
TIL和ICI治疗反应之间的联系也在其他免疫细胞类型中进行了研究。Ng等人分析了49例ICIs治疗患者的HCC样本，并报告肿瘤内高CD38＋CD68＋巨噬细胞的患者与低CD38＋CD68＋巨噬细胞的患者相比有更好的中位OS（34．43对9．66个月），可能是因为CD38hi巨噬细胞产生更多的IFN－＆gamma；以及相关的细胞因子。
对从6例HCC患者的外周血、肿瘤组织和邻近正常组织中分离的5063个T细胞进行深层单细胞RNA测序。结果表明，特定亚群，如耗竭的CD8＋T细胞和调节性T细胞（Treg），在HCC中优先富集。
尽管关注TME中的淋巴细胞很重要，但将其作为生物标志物应用于临床仍然很遥远。如何选择具有特定特征的淋巴细胞，如何确定阳性标准是许多尚未回答的问题之一。联合评估多个免疫细胞的数量和PD－L1的表达以制定TME评分可能是答案之一。
特异性基因改变
近年来，与NGS的出现相关的分子图谱提供了关于可操作靶点的信息，并确定了与ICIs反应相关的特定基因改变。
导致WNT／＆beta；－连环蛋白信号通路激活的CTNNB1基因突变是免疫排斥型HCC（冷肿瘤）的特征，并且与几种免疫特征的富集分数显著降低相关。与WNT野生型HCC相比，在31名接受不同ICI治疗的亚组患者中，WNT／＆beta；－连环蛋白通路的激活改变与较低的疾病控制率（0％对53％）、较短的中位PFS（2．0对7．4个月）和较短的中位OS（9．1对15．2个月）相关。
此外，TP53基因改变是HCC患者中最常见的突变，并且与CTNNB1突变相互排斥。研究表明，TP53的改变与肝癌的免疫微环境密切相关，CD8＋T细胞浸润较少，FOXP3＋Treg浸润较多，导致免疫反应下调。
最近的研究表明，免疫相关长非编码RNA（lncRNAs）可以预测肝癌的ICI治疗反应。Peng等人报道，lncRNA MIR155的宿主基因与肝癌组织中CTLA－4和PD－L1的表达呈强正相关，并对ICI治疗的疗效具有预测价值。此外，Zhang等人发现了一种与较差生存率相关的免疫相关的lncRNA标记，是肝癌患者的独立预后生物标志物。
一些研究表明，癌细胞固有的表观遗传学改变与癌变和肿瘤进展以及TME的变化有关，表明其作为免疫治疗预测因子的潜力。此外，鉴于DNA甲基化可以在液体活组织检查中测量，表观遗传学生物标记物可能提供额外的优势。
这些观察结果表明，存在特定的基因突变，特别是与CTNNB1、TP53、非编码RNA和甲基化相关的基因突变，可能通过与免疫微环境相互作用影响对ICI治疗的反应。尽管这些研究仍处于初步阶段，但这些改变可能代表肝癌患者选择的新生物标志物。
免疫相关基因标记
最近对肿瘤转录组分析数据进行了综合分析，以表征免疫微环境对ICI治疗的反应性。Ayers等人确定了18基因的T细胞炎症表达谱和6基因的IFN－＆gamma；标记，可预测多种实体瘤对pembrolizumab治疗的反应。
CheckMate 040试验结果的回顾性分析还包括对4基因炎症信号（PD－L1、CD8A、LAG3和STAT1）的预测价值的评估。在剂量递增和剂量扩展阶段，发现该特征与改善的应答和与nivolumab治疗相关的OS相关。最近，一个5基因免疫相关标记（LDHA、PPAT、BFSP1、NR0B1和PFKFB4）被确定并用于建立肝癌治疗反应的预后模型，该模型可以对免疫治疗敏感的患者进行分层。虽然这些免疫相关基因标记显示出预测ICI反应的潜力，但这些特征还需要进一步的临床应用测试。
外周血生物标志物
ICI治疗患者肿瘤样本的持续可用性对于生物标记物研究至关重要，然而，由于活检的侵入性，这很难实现。相比之下，循环生物标志物在治疗后可以很容易地收集和重复测量，使其更便于临床使用。
研究表明，TGF－＆beta；在TME内的免疫抑制和肿瘤免疫逃避中起着核心作用。在HCC中，TGF－＆beta；信号与耗竭的免疫信号之间存在强烈的相关性。在一项II期试验中，对29例接受pembrolizumab治疗的不可切除肝癌患者的几种代表性循环生物标志物进行了分析，结果表明，基线血浆TGF－＆beta；水平＜200 pg／mL是更好的OS和PFS的有效预测因子。
一些可溶性免疫检查点相关蛋白最近被证明在各种癌症类型中具有很好的预测价值。如PD－L1的外泌体，在一项研究中，循环外泌体PD－L1水平的增加幅度可以区分临床应答者和无应答者。此外，可溶性PD－L1（sPD－L1）与NSCLC患者的免疫治疗反应相关，而关于HCC患者缺乏相关数据，需要进一步研究。
外周血中的循环免疫细胞已被广泛评估为预测性生物标记物。在tremelimumab对HCC患者与局部区域治疗的联合试验中，发现在基线检查时，外周血单个核细胞中CD4＋PD－1＋细胞的频率在对治疗有反应的患者中高于无反应的患者。此外，在16例接受nivolumab治疗的肝癌患者中，观察到基线水平较低的外周血PD－1＋B细胞阳性和PD－L1＋单核细胞阳性与疾病控制相关。
循环肿瘤DNA（ctDNA）可以预测几种肿瘤对ICI治疗的反应。然而，一项使用ctDNA分析晚期HCC突变情况的研究报告，WNT通路相关突变与ICI治疗后的临床结果无关，表明需要进一步研究以确定ctDNA是否确实可以作为HCC的预测性生物标记物。
高甲胎蛋白（AFP）水平被认为是肝癌患者临床预后不良的一个预后标志物。最近，据报道，治疗后血清AFP水平下降与晚期HCC更好的ICI治疗效果有关。然而，checkmate040临床试验的结果表明，尽管基线AFP＜400＆micro；g／L比AFP＆ge；400＆micro；g／L与更长的OS相关，但无论基线AFP水平如何，ORR和DCR相似。鉴于AFP水平与患者的基线特征密切相关，应谨慎解释其预测效果。
外周血中的生物标记物具有低侵入性的巨大优势，同时大量研究也显示了其作为免疫治疗效果预测因子的潜力。然而，仍然缺乏来自大样本临床试验的支持性数据。此外，目前还没有证据表明，对于任何给定的生物标记物，血液样本的预测准确性优于组织样本。
肠道微生物
越来越多的证据表明，肠道微生物群在先天性和适应性免疫的发展和调节中起着至关重要的作用，研究发现，肠道微生物群与ICI治疗反应之间似乎存在一定的关系。
Zheng等人最近通过宏基因组测序报告了肝癌抗PD－1免疫治疗期间肠道微生物组组成的动态变化。他们观察到，与无应答者相比，免疫治疗应答者的粪便样本显示出更高的分类丰富度和更多的基因计数，反应组的微生物组成保持相对稳定，而无反应组的变形菌数量从第3周开始显著增加，并在第12周占优势。此外，据报道，ICI治疗开始时使用抗生素与更差的结果相关，表明肠道微生物群对HCC治疗的影响。目前正在进行一项临床试验（NCT03785210），以评估联合抗生素（万古霉素）和ICI疗法的疗效。
IRAE的潜在生物标志物
大多数研究集中于识别预测免疫治疗疗效的生物标记物，而研究与IRAE相关的生物标记物的研究相对较少。此外，大部分研究结果来自黑色素瘤患者。然而，这些研究可以作为识别预测HCC中IRAE的生物标志物的参考。
在接受ipilimumab治疗的患者中，基线血清IL－6和IL－17水平与严重毒性风险增加显著相关，其中IL－17与严重腹泻／结肠炎相关。一项涉及167名实体瘤成年患者的回顾性研究表明，在接受nivolumab或pembrolizumab治疗的患者中，基线淋巴细胞计数增加与IRAE风险增加相关。
未来的研究应该探索与ICI疗效相关的潜在生物学机制，同时如何平衡IRAE的发病率和免疫治疗反应也值得认真考虑。
小结
在HCC中，虽然已经进行了几项研究以确定预测性生物标记物，但HCC相关免疫治疗仍处于起步阶段，探索免疫治疗生物标记物预测疗效的基础研究和临床试验仍然有限，目前尚不可能确定哪些生物标记物可以有效预测免疫治疗的疗效。
特别值得注意的是，生物标志物在患者群体中经历动态变化。因此，在治疗前和治疗期间从患者身上获取样本以评估这些动态变化并正确确定评估生物标志物的预测价值至关重要，同时应充分考虑其在临床实践中的应用。NGS、单细胞RNA测序和人工智能等研究技术的发展将使我们更全面地了解TME的各种成分及其相互作用，并且可以在基因组尺度上广泛筛选潜在的生物标记物，以确定治疗效果的预测因子。
参考文献：
1．Biomarkers and Future Perspectives forHepatocellular Carcinoma Immunotherapy． Front Oncol． 2021； 11： 716844．
原文标题 ： 肝细胞癌免疫治疗的生物标志物
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