相干反斯托克斯拉曼散射(CARS)显微镜是细胞生物学中的重要工具。CARS允许无标记、非破坏分子成像，避免了标记对分子性质的影响，这一特点对于脂质或药物的成像非常重要。如图1所示，CARS成像需要泵浦光和斯托克斯光，两束光在空间和时间上重合，当二者之间的频率差与分子振动频率一致时，产生反斯托克斯光信号。为了提升光谱分辨率，泵浦光和斯托克斯光一般采用波长不同的皮秒变换极限脉冲。现实中，通过被动锁模产生宽光谱飞秒脉冲更为容易，但如果泵浦光和斯托克斯光同为变换极限飞秒脉冲，则会同时激发多个分子振动，从而牺牲了光谱特异性，本期介绍的延迟双梳光谱聚焦技术是克服这一瓶颈的有效手段。
图1.CARS的过程[1]
光谱聚焦通过控制脉冲啁啾来优化宽带飞秒激光源的瞬时光谱宽度。如图2所示，对泵浦脉冲和斯托克斯脉冲引入线性啁啾后，啁啾脉冲具有较窄的瞬时带宽，提高了光谱分辨率。在此基础上引入不同的延迟，即可实现对于不同分子振动的激发。
图2.光谱聚焦技术[2]
双梳光谱聚焦如图3(a-c)所示，泵浦光和斯托克斯光两个脉冲序列的重复频率不同，相差△f。通过重频的微小差异改变两个脉冲之间的延迟，完成对不同瞬时频率差的扫描。然而这种方法导致了较低的占空比，图3(d-f)介绍了延迟双梳光谱聚焦的原理，斯托克斯脉冲和泵浦脉冲在一个刷新频率中不再重叠之后，通过改变激光器的重复频率，将△f变为原来的负值，使得两束脉冲延迟相反趋势变化，进入一个新的刷新周期。
图3.延迟双梳光谱聚焦[3]
图4(a)为实验装置图。泵浦脉冲由商业锁模Yb光纤激光器提供，中心波长为1050 nm，斯托克斯脉冲由掺Er光纤激光器提供，中心波长为1560 nm。两束光对应波数差3000 cm-1，这对应了拉曼成像中的高波数区域，可以识别甘油三酯、胶原蛋白和髓鞘等组织成份，这有助于提高医学临床诊断的准确性。图4(b)是Er光纤激光器的腔内结构，一个锂酸盐的电光调制器根据外来信号改变内置晶体的折射率改变激光的腔长，从而改变重复频率。此外来信号来自BBO和频模块，当两脉冲不再重叠时二次谐波信号消失，EOM迅速调节反转脉冲的扫描方向。泵浦光和斯托克斯光被展宽至5 ps和2.1 ps之后聚焦到样本上，滤波后通过雪崩二极管收集信号。
图4.实验装置[3]
作者利用该CARS显微镜对PS(polystyrene 聚苯乙烯)材料塑料小球成像，5 ms时间内流动的PS小球拉曼光谱轨迹图如图5所示，其峰值在3050 cm-1处。
图5.基于延迟双梳光谱聚焦的成像[3]
该工作发展了基于100 MHz光纤激光器的延迟双光梳CARS技术，测量刷新频率高达40 kHz，同时保证了较高信噪比。这项技术兼具高效率和低成本优势，有望在非线性光学显微成像中发挥重要应用。
参考文献：
[1] Hashimoto M . Coherent Anti-Stokes Raman Scattering Microscopy[J]. ACTA HISTOCHEMICA ET CYTOCHEMICA, 2002.
[2]Mohseni Mojtaba, Polzer Christoph, Hellerer Thomas. Resolution of spectral focusing in coherent Raman imaging.[J]. Optics express,2018,26(8). M. Gebhardt, C. Gaida, F. Stutzki, S. Hädrich, C. Jauregui, J. Limpert, and A. Tünnermann, Opt. Express 23, 13776 (2015).
[3] Zhang Y , Lu M , Wu T ,et al. Delay-Spectral Focusing Dual-Comb Coherent Raman Spectroscopy for Rapid Detection in the High-Wavenumber Region[J].ACS Photonics 2022, 9, 4, 1385–1394
原文标题 : 多光子显微镜成像技术之四十三 基于延迟双梳光谱聚焦的CARS成像
（来源：维科网）
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